Tubulin-Isotypen in ein- und zweidimensionaler PAGE

Abb. 88 a-f Tubulin-Isoformen nach 2D-PAGE und Western Blot. Die Proteine wurden zuerst in der 2D-PAGE aufgetrennt und dann auf Nitrocellulosemembranen geblottet. Die geblotteten Proteine wurden mit verschiedenen monoklonalen Antikörpern nachgewiesen. Alle Blots sind so angeordnet, daß der pH von rechts nach links steigt und das Molekulargewicht von oben nach unten abnimmt.

Abb. 88a Tubulin-Isotypen, die mit dem mAK ID5 nachgewiesen werden Auf den Western Blots von 2D-Gelen sind mit diesem Anti-Glu-Tubulin mAK zwei undeutlich voneinander abgegrenzte Spots identischen Molekulargewichts zu unterscheiden.

Abb. 88b Tubulin-Isotypen, die mit dem mAK 27C2 markiert werden Dieser Anti-Tyr-Tubulin Antikörper markiert zwei Proteinpunkte identischen Molekulargewichts.

Abb. 88c Doppelmarkierung mit den Antikörpern 27C2 und ID5 Der Western Blot aus Abb. 88b wurde nach dem Fotografieren mit dem Antikörper ID5 und dem dazugehörigen Zweitantikörper behandelt. Die Größe der nachgewiesenen Proteinspots hat sich vergrößert, weil der mAK ID5 im Western Blot intensiver als der mAK 27C2 reagiert. Die Antikörper 27C2 gegen tyrosiniertes Tubulin und ID5 erkennen die gleichen Proteine, aber unterschiedlich gut.

Abb. 88d Tubulin-Isotypen, die von dem mAK TAT1 erkannt werden Der Antikörper TAT1 reagiert sehr intensiv mit den Proteinen von Reticulomyxa. Zusätzlich zu den vier eng benachbarten Proteinspots werden einige andere Proteine - wahrscheinlich unspezifisch - markiert.

Abb. 88e Doppelmarkierung mit dem Antikörpern TAT1 und ID5 Der Western Blot aus Abb. 88d wurde nochmals mit dem mAK ID5 markiert. Zwischen den beiden Antikörpermarkierungen besteht keine Übereinstimmung. Das Protein, das von dem mAK ID5 erkannt wird, ist deutlich leichter als das von dem mAK TAT1 markierte.

Abb. 88f Doppelmarkierung mit den Antikörpern Nr.11 und ID5 Der mAK Nr.11 ist gegen das b-Tubulin von Reticulomyxa gerichtet. Er erkennt vier Isotypen, zwei deutlich erkennbare Hauptformen und zwei wesentlich schwächere Nebenformen. Dieser Blot ist zugleich auch mit dem mAK ID5 gegen Glu-a-Tubulin markiert, um die großen Gewichtsunterschiede zwischen dem extrem leichten a-Tubulin und dem außergewöhnlich schweren b-Tubulin zu veranschaulichen.

 

Abb. 89 a-d Elektrophoretische Massenbestimmung der Tubuline Wie im Abschnitt "Material und Methoden" erläutert, wurden die Zellextrakte und der Molekulargewichtsmarker auf ein Gel aufgetragen und nach dem Gellauf auf Nitrocellulose geblottet. Die Position der Markerproteine wurde nach Poinceaurot-Färbung markiert und ist auf der linken Seite der Blots eingezeichnet. Die Proteine wurden mit Antikörpern nachgewiesen.

Abb. 89a Markierung des leichten a-Tubulins mit dem mAK ID5 Es wird nur eine Bande mit einem MW von ca. 48 kDa markiert.

Abb. 89b Markierung mit den mAKs ID5 und Nr.11 Der mAK 1D5 gegen Glu-a-Tubulin markiert auch auf diesem Blot ein Protein von ca. 48 kDa. Der mAK Nr.11 gegen Reticulomyxa b-Tubulin markiert eine Bande bei ca. 58 kDa. Im unteren Bereich des Blots ist noch eine Bande aus protolysiertem Tubulin zu erkennen.

Abb. 89c Western Blot mit dem mAK TAT1 gegen a-Tubulin Der mAK TAT1 erkennt nur eine - allerdings etwas verschmierte Proteinbande bei ca. 52 kDa. Eine weitere Proteolysebande im niedermolekularen Bereich ist ebenfalls schwach markiert.

Abb. 89d Western Blot mit dem mAK gegen Reticulomyxa-g-Tubulin Die Markierung des g-Tubulins durch den entsprechenden Antikörper liegt etwas unterhalb des 46 kD-Markers. Die Immunmarkierung des geblotteten g-Tubulins ist nur schwach zu erkennen.

 

Abb. 90 Tubuline von Reticulomyxa im 2D-Gel Nachdem die genaue Lage der Tubuline von Reticulomyxa bekannt war, wurden zweidimensionale Elektrophoresen durchgeführt, in denen der fragliche Bereich durch ein anderes Mischungsverhältnis der Ampholyte in der IEF sowie ein grobporigeres Gel (10%) in der SDS-PAGE besser aufgetrennt wurde. Ein solches Gel zeigt diese Abbildung. Die Positionen der verschiedenen Tubulin-Isotypen sind markiert.

Tafel16