Cytoskelettkomponenten des plasmodialen Rhizopoden

Reticulomyxa filosa

Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Abteilung für Biologie an der Ruhr-Universität Bochum

Vorgelegt von

Ralf N. Breuker

aus Witten

Bochum, im April 1997

 

Abkürzungsverzeichnis

1

Einleitung

2

Material und Methoden

2.1

Kulturhaltung

2.1.1

Kultur von Reticulomyxa filosa

2.1.2

Experimentelle Bedingungen

2.2

Agenzien

2.3

Herstellung von Zellmodellen

2.3.1

Triton-Lysis im Kulturmedium

2.3.2

Lysis in Vanadat-haltigem MT-stabilisierendem Medium

2.4

Lichtmikroskopie

2.4.1

Lebenduntersuchungen

2.4.1.1

Reflexionskontrast

2.4.2

Fluoreszenzmarkierungen

2.4.2.1

Phalloidin

2.4.2.1.1
Actin-Darstellung mit Rhodamin-konjugiertem Phalloidin
2.4.2.1.2
Beobachtung im Reflexionskontrast mit anschließender Actin-Darstellung

2.4.2.2

Indirekte Immunfluoreszenz

2.4.2.2.1
Fixierung und Antikörperinkubation für die IIF

2.4.2.3

Heterologe Tubulin-Polymerisation

2.4.2.4

Auswertung der fluoreszenzmarkierten Präparate

2.5

Elektronenmikroskopie

2.5.1

Epon-Einbettungen und Ultradünnschnittechnik

2.5.1.1

Fixierung

2.5.1.2

Entwässerung und Epon-Einbettung

2.5.1.3

Schnittherstellung und -auswertung

2.5.2

"Hook-Dekoration"

2.5.2.1

Tubulin-Isolation für die "Hook-Dekoration"

2.5.2.2

Durchführung der "Hook-Dekoration"

2.5.2.3

Auswertung der "Hook-Dekoration"

2.6

Gelelektrophorese

2.6.1

SDS-PAGE

2.6.1.1

Molekulargewichtsbestimmung

2.6.2

Western Blot

2.6.3

2-Dimensionale Elektrophorese

2.6.3.1

Bestimmung der isoelektrischen Punkte

2.6.4

Massenspektroskopie

2.7

Bezugsquellennachweis

2.7.1

Antikörper

2.7.2

Chemikalien

3

Ergebnisse

3.1

Polarität von MT und Eigenschaften der MTOCs

3.1.1

Hook-Dekoration

3.1.2

6-DMAP

3.1.3

Lokalisation von MTOCs

3.1.4

Heterologe Polymerisation von Mikrotubuli

3.2

Beeinflussung des MT-Polymerisationsverhaltens

3.2.1

Kältebehandlung

3.2.2

Calcium-Inkubation

3.2.3

Lanthan

3.2.4

Nocodazol

3.2.5

MgCl2

3.2.6

Taxol

3.3

Actinverteilung und Anheftungsstellen in Reticulomyxa

3.3.1

Actinorganisation im RPN von Reticulomyxa filosa

3.3.2

Zelladhäsion und beteiligte Cytoskelettelemente

3.4

Cystenbildung

3.4.1

Ruhestadien

3.4.2

Cysten

3.5

Tubulin-Isoformen und ihre Verteilung

3.5.1

Tubulin-Isoformen in 2D-PAGE und Western Blot

3.5.1.1

Bestimmung der Molekulargewichte

3.5.1.2

Lokalisation des Reticulomyxa-Tubulins in der 2D-PAGE

3.5.1.3

Vergleich des Tubulingehalts zwischen Cysten und ausgelaufenen Zellen

3.5.2

Massenspektrometrische Charakterisierung des Reticulomyxa-Tubulins

3.5.3

Verteilung der Tubulin-Isoformen in der Indirekten Immunfluoreszenz

3.5.3.1

a-Tubulin

3.5.3.2

b-Tubulin

3.5.4

Zusammenfassung: Tubulin-Isotypen

4

Diskussion

4.1

MTOCs und die Polarität von Mikrotubuli

4.1.1

Beschaffenheit und Lage von MTOCs

4.1.2

Polarität der MT

4.1.3

Die Wirkung von 6-DMAP

4.2

Beeinflussung des MT-Polymerisationsverhaltens

4.2.1

Taxol

4.2.2

Die MT-depolymerisierenden Agenzien Colchicin und Nocodazol

4.2.3

Die Wirkung von Kälte auf die Polymerisation von Mikrotubuli

4.2.4

Die Wirkung von Calcium und des Calcium-Antagonisten Lanthan auf das MT-Cytoskelett

4.3

Übergänge zwischen den Tubulin-Aggregationsformen

4.3.1

Vinca-Alkaloide und die Entstehung helikaler Filamente

4.3.2

Ultrastruktur helikaler Filamente in Vertretern der Granuloreticulosea

4.3.3

Direkte Umwandlung von Mikrotubuli in helikale Filamente

4.3.4

Umwandlung von helikalen Filamenten in MT

4.4

Das Actin-System

4.4.1

Die Bedeutung von Actin im Cytoskelett von Reticulomyxa

4.5

Cysten und Ruhestadien

4.5.1

Ruhestadien

4.5.2

Cysten

4.6

Tubulin-Isotypen im Cytoskelett von Reticulomyxa

4.6.1

Tubulin-Isoformen in Reticulomyxa filosa

4.6.1.1

Massenbestimmung und Verteilung in der Zelle

4.6.1.2

Bedeutung der außergewöhnlichen Tubulin-Isoformen für die Cytoskelettorganisation

4.6.2

Tubulin-Isotypen in Reticulomyxa filosa

4.6.2.1

Die Isotypen des leichten a-Tubulins: Das Glu/Tyr Paradoxon

4.6.2.2

Die vier Isotypen des a2-Tubulins

4.6.2.3

Die vier Isotypen des b2-Tubulins

4.6.2.4

Bedeutung der außergewöhnlichen Tubulin-Isotypen für die Cytoskelettorganisation

5

Zusammenfassung

5.1

Dynamik des mikrotubulären Cytoskeletts

5.2

Actinorganisation und Zelladhäsion

5.3

Tubulin-Isoformen, Glu/Tyr Paradoxon

5.4

Cysten

6

Literatur

 

Abbildungsverzeichnis


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