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1 Einleitung

Mit der Evolution zur Eucyte entstand für die Organismen die Notwendigkeit, zusätzlich zu den Mechanismen für die Bewegung ganzer Zellen, Strukturen zu entwickeln, die den intrazellulären Transport von Organellen und Nährstoffen gewährleisten. Zwei Systeme, die diesem Zweck dienen, sind hier in erster Linie zu nennen: Das Actinomyosinsystem, das hauptsächlich zur Bewegung des Zellkörpers eingesetzt wird, aber auch in Einzelfällen dem intrazellulären Transport einzelner Zellorganelle dient, und das Mikrotubulisystem, das vorrangig Stütz- und Transportfunktionen erfüllt, darüberhinaus aber noch zahlreiche andere Aufgaben erfüllen kann.

Mikrotubuli sind röhrenförmige Strukturen von ca. 25 nm Durchmesser, die aus zwei globulären Untereinheiten, den sauren Proteinen a- und b-Tubulin, aufgebaut sind. In vivo kommen die Tubuline jedoch nicht frei vor, sondern es sind je ein a- und ein b-Tubulin zu einem hantelförmigen Heterodimer vereinigt. Mikrotubuli bestehen meistens aus 13 Heterodimeren, die parallel orientiert zu einem Hohlzylinder zusammengelagert sind (Amos, 1979). Die Längsreihen der Heterodimere nennt man Protofilamente. Bei der Addition von Tubulin an einen Mikrotubulus wird das an das b-Tubulin reversibel gebundene GTP zu GDP + P hydrolysiert (Majillano et al., 1990, Bayley et al. 1989a, 1989b, i Martin et al., 1990).

Dieses vergleichsweise einfache System ist zudem evolutionär hochkonservativ. Luduena (1979) konstatiert für Tubulin eine mittlere Mutationsrate von 0,45 akzeptierten Punktmutationen auf 100 Aminosäurereste pro 100 Millionen Jahre. Modifikationen der Tubuline und damit auch der daraus bestehenden Mikrotubuli erfolgen zumeist nicht auf genetischer Ebene, sondern posttranslationell (Review in: Greer und Rosenbaum, 1988) durch Tyronisierung/Detyronisierung des C-Terminus des a-Tubulins oder Acetylierung der e-Aminogruppe des Lysins am a-Tubulin.

Durch den Aufbau aus parallel orientierten Heterodimeren ist die Grundlage für die morphologische Polarität der Mikrotubuli gelegt. An einem Ende des Mikrotubulus sind die freien a-Tubuline des Heterodimers lokalisiert, an dem entgegengesetzten Ende ist ungebundenes b-Tubulin exponiert. Diese molekulare Polarität spiegelt sich auch in der Kinetik der Additionsreaktion von freiem GTP-Tubulin an dem Mikrotubulus bzw. der Abspaltung von GDP-Tubulin vom Mikrotubulus wieder. Während das Ende des Mt, an dem die freien b-Tubuline exponiert sind, schnell durch Addition von GTP-Tubulin wächst und schnell durch Abgabe von GDP-Tubulin schrumpft, ist das Ende des Mt, an dem die a-Tubuline exponiert sind, in beiden Reaktionen träger (Martin et al. 1991). Daher wird auch das schnell wachsende und schnell schrumpfende Ende als Plusende bezeichnet, und das andere als Minusende. Da es sich bei Wachstum und Schrumpfung eines Mt-Endes um keine simple Gleichgewichtsreaktion handelt, sondern die Wahrscheinlichkeit eines wachsenden Endes, weiter zu wachsen, größer ist als diejenige zu schrumpfen (und umgekehrt bei schrumpfenden Enden), wird angenommen, daß neben der Polarität der Mt die Existenz (noch) nicht hydrolysierten GTPs an dem jeweiligen Mt-Ende für die Wahrscheinlichkeit, weiter zu wachsen, ausschlaggebend ist (Voter et al., 1991). Dieses Phänomen der Stabilisierung im wachsenden Zustand durch ein GTP-Cap und der Instabilität im schrumpfenden Zustand wegen des fehlenden Caps geht so weit, daß in vitro ganze Populationen von Mt gleichzeitig bis zum Verbrauch eines Großteils des freien GTP-Tubulins wachsen und dann gemeinsam schrumpfen (Caplow und Shanks, 1989, Mandelkow et al. 1989). In vivo kommt zusätzlich zu der durch die innere Struktur des Mikrotubulus bedingten Polarität noch hinzu, daß das langsam wachsende Ende des Mt fast immer von Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOCs) geschützt ist und deshalb so gut wie gar nicht schrumpft (Review in Brinkley, 1985). Das Plusende der Mt ist hingegen meist frei; eine bekannte Ausnahme von dieser Regel sind die chromosomalen Spindelfasern, deren Plusenden in die Kinetochore der Chromosomen eingebettet sind.

Zusätzlich zu den schon geschilderten Unterschieden zwischen Mikrotubuli durch posttranslationelle Modifikation der Tubuline oder Caps aus GTP kommen noch strukturelle Unterschiede zwischen Mikrotubuli vor. So unterscheidet man zwischen A- und B-Tubuli. Bei den letzteren sind die benachbarten Heterodimere homolog angeordnet, also so, daß a-Tubulin neben a-Tubulin zu liegen kommt. Bei A-Tubuli ist die Anordnung der Heterodimere heterolog, die Heterodimere sind gegeneinander versetzt. Die meisten cytoplasmatischen Mt sind B-Tubuli (Unger, Böhm und Vater, 1990) , wohingegen die stabilen Mt der Cilien und Flagellen A-Tubuli sind. Bei in vitro Polymerisationsversuchen von Tubulin zeigt sich, daß auch die 13-Protofilament -Anordnung der Mt keine konstante Größe ist. Je nach verwendetem Tubulin und den Reaktionsbedingungen entstehen in vitro Mt von 8 bis 17 Protofilamenten (Unger et al., 1990).

Die Anzahl der Protofilamente bei in vivo erzeugten Mt wird nicht von dem Tubulin selber, sondern von dem MTOC festgelegt (Evans, Mitchison und Kirschner, 1985). Auch hier gibt es jedoch Abweichungen von der üblichen Anzahl von 13 Protofilamenten (Eichenlaub-Ritter und Tucker, 1984). Zum Teil wechselt die Anzahl der Protofilamente auch innerhalb eines Organismus von Zelle zu Zelle oder innerhalb einer Zelle in Abhängigkeit von den Stadien der Zelldifferenzierung (Tucker et al. 1986).

Die starre Organisation des Tubulins in Mikrotubuli ist nicht seine einzige Aggregationsform. Außerdem werden noch Tubulinringe und -spiralen, C- oder S-förmige Protofilamentblätter , doppelwandige Mt, Makrotubuli, helicale Filamente und die daraus bestehenden Tubulin-Parakristalle gefunden (Review in Unger, Böhm und Vater, 1990). Während viele dieser Tubulin-Aggregate reine Kunstprodukte sind, die in lebenden Zellen nicht zu finden sind, und C- und S-förmige Tubulinsheets als Intermediärprodukte beim Auf- oder Abbau von Mt aufzufassen sind (Simon und Salmon, 1990), kommt den helicalen Filamenten und Parakristallen in diesem Zusammenhang eine besondere Bedeutung zu, da sie in einigen Organismen ständig angetroffen werden, ohne daß ihre physiologische Bedeutung oder die Entstehung ihrer Struktur hinreichend geklärt wäre (Dustin, 1978).

Mit der Funktion der Mikrotubuli als Cytoskelett und Basis für den intrazellulären Transport von Organellen untrennbar verbunden sind zahlreiche Mikrotubuli-assoziierte-Proteine (MAPs). Schliwa (1986) geht sogar so weit, alle cytoplasmatischen Strukturkomponenten , die irgendwie an der Triebkrafterzeugung beteiligt sind, zum Cytoskelett zu rechnen. Drei MAPs, die der Bewegung von Zellorganellen dienen müssen hier genannt werden: Dynein, Kinesin und Dynamin (Review in Vallee und Shpetner, 1990). Dynein ist das am längsten bekannte Mt-assoziierte Motorprotein. Es wurde erstmals 1963 von Gibbons in Cilien und Flagellen gefunden. Daß das dem axonemalen Dynein verwandte MAP 1C auch für viele cytoplasmatische Transportvorgänge verantwortlich ist, wurde erst sehr viel später aufgeklärt (Gibbons, 1988).

Beim Transport entlang von Mikrotubuli wandert cytoplasmatisches Dynein unter ATP-Verbrauch mit einer Geschwindigkeit von durchschnittlich 1,25 mm/s (Vallee und Shpetner, 1990) zu deren Minusende, also zum Zellkörper hin oder auch retrograd. Die anderen beiden Mt-assoziierten Motorproteine bewirken den anterograden, vom Zellkörper fort gerichteten Transport von Zellorganellen. Das erst 1985 von Vale et al. identifizierte Kinesin ist mit seiner Wandergeschwindigkeit von 1 - 5 mm/s unter anderem für den schnellen axonalen Transport verantwortlich (Vale, Scholey und Sheez, 1986). Das für den langsamen Transport in Axonen zuständige Dynamin wurde als letztes Protein dieser Gruppe erst 1989 (Shpetner und Vallee, 1989) isoliert und identifiziert, es wandert mit einer Geschwindigkeit von 0,2 - 1 mm/s zum Plusende des Mikrotubulus.

Die vorangehenden Ausführungen hinsichtlich der Direktionalität der Motorproteine müssen jedoch in einem Punkt wieder eingeschränkt werden: Bei der Süßwasseramöbe Reticulomyxa filosa wurde bisher nur ein einziges Motorprotein gefunden (Schliwa, Euteneuer und Koonce, 1986), das sowohl für den anterograden als auch für den retrograden Transport zuständig zu sein scheint (Euteneuer et al., 1989).

Schliwa et al. (1991) haben nachgewiesen, daß die Enzymkinetiken der beiden Transportrichtungen in Reticulomyxa nahezu identisch sind und daß die Akzeptanz dieses vermutlich bidirektionell arbeitenden Motorproteins für verschiedene synthetische Analoga des Energielieferanten ATP ähnlich der von Tetrahymena-Dynein ist. Möglicherweise liegt bei Reticulomyxa also eine Form des Dyneins vor, die fähig ist, Organelle in beide Richtungen entlang eines Mikrotubulus zu transportieren. Eine andere, hypothetische, Möglichkeit zur Erklärung der identischen Enzymkinetiken wäre, daß die Mikrotubuli von Reticulomyxa filosa nicht, wie bei anderen Organismen beobachtet, immer streng mit ihrem Plusende zur Zellperipherie gerichtet angeordnet sind. Versuche, durch Dekoration mit Dynein die Polarität von Mikrotubuli zu bestimmen, erbrachten jedoch, daß die beobachteten Mikrotubuli sehr wohl dieser Standardanordnung folgen (Euteneuer et al., 1989).

Auch aus anderen Gründen sind Reticulomyxa filosa (Nauss, 1949) und die phänotypisch ähnliche, jedoch nicht unmittelbar verwandte Allogromia laticollaris (Arnold, 1948) für die Untersuchung des Cytoskeletts wichtige Versuchsobjekte.

Beide Organismen zählen im Reich der Protisten zum Stamm der Sarcomastigophora, und innerhalb desselben zu dem Unterstamm Sarcodina, der Überklasse Rhizopoda und der Klasse Granuloreticulosea (Levine et al., 1980). Diese Klasse zeichnet sich durch den Besitz feiner, granulärer oder hyaliner Reticulopodien (selten auch Pseudopodien) aus (Levine et al., 1980). Während Reticulomyxa filosa jedoch zu der ersten Ordnung dieser Klasse, Athalamida, gezählt wird, gehört Allogromia laticollaris zur Unterordnung Allogromiina der dritten Ordnung der Granuloreticulosea, den Foraminiferida.

Die Foraminiferida sind eine evolutionär sehr alte Ordnung der Protisten, die dank ihres stabilen Kalkgehäuses hervorragend petrifiziert wird und fossil seit dem Kambrium belegt ist (Travis und Bowser, 1988). Seit dieser Zeit haben sich die Foraminiferida zumindest im Habitus kaum noch verändert. Während Allogromia eine marine, benthonisch lebende monothalame Foraminifere und Reticulomyxa im Gegensatz dazu eine unbeschalte polyenergide Süßwasseramöbe ist, unterscheiden sich die beiden Organismen in ihrem sonstigen Habitus nur wenig. Beide bilden ein feines Netzwerk aus Reticulopodien aus, das im Fall von Allogromia mehrere Quadratmillimeter, im Fall von Reticulomyxa mehrere Quadratzentimeter bedecken kann. Diese reticulopodialen Netzwerke (RPN) zeichnen sich durch durch eine hohe Formvariabilität aus. Einzelne Filopodien verlängern sich mit Geschwindigkeiten von bis zu 10 mm pro Sekunde (Allogromia: Travis und Bowser, 1988; Reticulomyxa: Koonce et al., 1987), schrumpfen mit noch größerer Geschwindigkeit (Chen und Schliwa, 1990), fusionieren miteinander oder fächern zu breiten Lamellipodien aus.

Entlang der feinen Filopodien, deren Stützgerüst aus Mikrotubuli besteht, findet bidirektionaler Transport von Organellen statt. Koonce und Schliwa (1985) beobachteten, daß sich einzelne Partikel oder Organelle mit einer Geschwindigkeit von bis zu 25 mm pro Sekunde die Filopodien entlang bewegten und dabei zu spontaner Richtungsumkehr in der Lage sind. Bidirektionaler Transport erfolgte sogar an Filopodien, in denen mit elektronenmikroskopischen Methoden nur ein einziger Mikrotubulus nachzuweisen war. Ähnliche Bewegungen wie die Organelle können auch die Mikrotubuli selbst ausführen. Koonce et al. (1987) zeigten, daß sich die Mikrotubuli eines Filopodiums von Reticulomyxa unter ATP-Verbrauch sowohl axial als auch lateral gegeneinander bewegen können. Einzelne Mikrotubuli können nicht nur gegeneinander gleiten, sondern sich auch aus einem Mt-Bündel lösen und sich später mit diesem oder einem anderen Bündel wiedervereinigen.

Unterschiede zwischen dem Cytoskelett der beiden Organismen bestehen unter anderem in der Verteilung von Aktin. Während Allogromia lokale Häufungen von Aktinfilamenten an Haftpunkten, ähnlich den adhesion plaques kultivierter Fibroblasten aufweist (Bowser et al, 1988), zeigen die Aktinfilamente in Reticulomyxa eine ähnliche Verteilung wie die Mikrotubuli (Lindenblatt, 1988), bilden aber an der Front von Lamellipodien ebenfalls plaques aus (Hauser, Lindenblatt und Hülsmann, 1989).

Neben dem bereits erwähnten Phänomen, daß in Reticulomyxa wahrscheinlich ein bidirektionales Motorprotein entlang der Mikrotubuli wirkt, prädestinieren das reiche Vorkommen von Mikrotubuli sowie deren schneller Auf- und Abbau beide Organismen geradezu dafür, als Untersuchungsobjekte für die Erkundung der Mechanismen der Cytoskelettdynamik zu dienen.

Beiden Organismen ist zwar das Phänomen der rapiden Umorganisation des Mikrotubuli-Netzwerks gemein, über die Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOCs) ist jedoch fast nichts bekannt. Bei Reticulomyxa wurden bislang überhaupt keine MTOCs gefunden (Euteneuer et al., 1989); Allogromia verfügt zwar während er Mitose und Meiose über Centriole (Hauser, pers. Mitteilung), jedoch scheinen diese nicht Ursprung der Ausbildung filopodialer Mikrotubuli zu sein. Die Identifikation von Zentren, die hier Mikrotubuli organisieren, wäre jedoch ein wichtiger Schritt hin zu der Beantwortung so grundlegender Fragen, wie der nach dem Anfang (und Ende) der Mikrotubuli, und welchen Anteil die Verlängerung von Mikrotubuli an der Verlängerung der Filopodien hat, und welchen die Translokation von Mikrotubuli durch Motorproteine. Zusätzlich findet man in beiden Organismen unter physiologischen Bedingungen häufig die bereits erwähnten helicalen Filamente in den Filopodien. Die Untersuchungen von Hauser und Schwab (1974) legen nahe, daß diese helicalen Filamente bei Allogromia direkt aus den Mikrotubuli hervorgehen.

Bei Reticulomyxa fanden Hauser und Lindenblatt (1989), daß die Mikrotubuli dieses Organismus ausschließlich aus Glu-Tubulin bestehen. Glu-Tubulin ist jedoch charakteristisch für ältere Mikrotubuli, was in krassem Widerspruch zu der Tatsache steht, daß die Mt-gestützten Filopodien bei Reticulomyxa ständig umgebaut werden. Eine mögliche Erklärung für diesen Widerspruch wäre, daß die Mikrotubuli von Reticulomyxa bei der Umgestaltung des Cytoskeletts nicht in freies Tubulin, sondern in helicale Filamente umgebaut werden (Hauser und Lindenblatt, 1989). Ein Verständnis des Mechanismus, der die mögliche Umwandlung von Mikrotubuli in helicale Filamente bewirken könnte, hätte nicht nur Auswirkungen auf das Verständnis des Cytoskeletts der untersuchten Organismen, sondern würde außerdem die Wirkung der Vinca-Alkaloide erklären helfen, die bei anderen Organismen ebenfalls die Bildung helicaler Filamente induzieren können.

In der vorliegenden Arbeit soll das Cytoskelett von Reticulomyxa filosa und Allogromia laticollaris mit licht- und elektronenmikroskopischen Methoden dargestellt und untersucht werden. Das Ziel dieser Untersuchungen ist es, die Interaktionen der verschiedenen Cytoskelettkomponenten zu beobachten und mögliche Faktoren, die in die rapide Umgestaltung des Cytoskeletts bei diesen Organismen involviert sind, zu ermitteln.

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